共焦激光扫描显微镜

激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图象仪器。它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。

利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。

共焦距显微镜的含义

共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）是近十多年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源，由共聚焦成像扫描系统、电子光学系统和微机图像分析系统组成。光束经聚焦后落在样品(组织厚片或细胞)不同深度的微小一点，并作移动扫描，通过电信号彩色显像，可使样品内任何一点的反射光形成的图像，都被准确地接收下来并产生信号，传递到彩色显示器上，再连接微机图像分析系统进行分析处理。

共聚焦显微镜的工作原理。

共聚焦系统的光源为离子激光器或HeNe激光器，光源发出的激光束通过照明针孔后成为点光源P。点光源P通过分束器进入高数值孔径显微物镜的成像系统成像后，在部分透明的被测样品内形成像点P。从像点P发出的散射光及反射光(波长为λ1)和其他荧光(波长λf>λ1),反方向经过物镜和分光镜后，入射到单点探测器。单点探测器由探测器和放置在探测器前的针孔组成，它可以减少探测器的有效面积。探测器一般使用的是光电倍增管或雪崩光电二极管，探测器接收到的电信号最后由计算机进行处理。

①如果激光束聚焦点的直径小于针孔的直径,则P处的针孔可以去掉。

②有些材料能自发荧光,有些材料则需要用合适的染料上色。

激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描

组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。

在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。 以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。

请问什么是共聚焦显微技术

共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术，目前应用领域扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中，成为现代生物学微观研究的重要工具。

共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和数字共聚焦显微技术两种。共聚焦技术具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察、活细胞内动态生理反应的实时观察记录、定性定量分析等优势，可以应用于亚细胞水平中观察离子水平的变化并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系等。

光显微镜与激光共聚焦显微镜的相同点

一、原理不同

1、荧光显微镜：是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。

2、激光共聚焦显微镜：在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。

二、特点不同

1、荧光显微镜：用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光。

2、激光共聚焦显微镜：利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。

三、用处不同

1、荧光显微镜：荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

2、激光共聚焦显微镜：激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域 得到广泛应用。