分光光度计的原理和使用方法

分光光度计介绍：

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。该仪器是食品厂、饮用水厂办理QS、HACCP认证的必备检验设备。

分光光度计原理：

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

分光光度计组成：主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

分光光度定义：

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。

常用的波长范围：

（1）200～400nm的紫外光区

（2）400～760nm的可见光区

（3）2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区

所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。

分光光度计的重要配件—— 比色杯

比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。

分光光度计操作方法：

1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。

2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较）。

3.根据所需波长转动波长选择钮。

4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。

6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。

7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

分光光度计注意事项：

1．该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。

2．使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。

3．在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。

分光光度计的使用方法

　　1.使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。以及各个操作旋钮之功能。在未接通电源前，应该对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源 开关 。仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的硅胶干燥筒(在仪器的左侧)，如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶或者倒出原硅胶，烘干后再用。

　　2.将灵敏度旋钮调置“1”档(放大倍率最小)。

　　3.开启电源， 指示灯 亮，选择开关置于“T”，波长调至测试用波长。仪器预热20分钟。

　　4.打开试样室盖(光 门 自动关闭)，调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上试样室盖，将比色皿架置与蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。

　　5.如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能置低倍率档使用，这样仪器将有更高的稳定性。但改变倍率后必须按(4)重新校正“0”和“100%”。

　　6.预热后，按(4)连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。

　　7.吸光度A的测量按(4)调整仪器的“00.0”和“100%”，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。

　　8.浓度C的测量：选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。

　　9.如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，(因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。

分光光度计的调节与使用

1.

仪器的基本操作 1、预热为使仪器内部达到热平衡，开机后预热时间不小于30 分钟。开机后预热时间小于30 分钟时，请注意随时操作置0%(T)、100%(T)，确保测试结果有效。注意：由于仪器检测器（光电管）有一定的使用寿命，应当尽量减少对光电管的光照，所以在预热的过程中应打开样品室盖，切断光路。

2.

改变波长通过旋转波长调节手轮可以改变仪器的波长显示值(顺时针方向旋转波长调节手轮波长显示值增大，逆时针方向旋转则显示值减少)。调节波长时，视线一定要与视窗垂直。

3.

置参比样品和待测样品 （1）选择测试用的比色皿；（2）把盛好参比样品和待测样品的比色皿放到四槽位样品架内；（3）用样品架拉杆来改变四槽位样品架的位置。当拉杆到位时有定位感，到位时请前后轻轻推拉一下以确保定位正确。1、置100%(T)目的: 校正读数标尺的零位，配合置0%(T)进入正确测试状态。调整时机: 改变测试波长时；测试一段时间后。操作: 将用作参比的样品置入样品室光路中，关闭掀盖后按 “100%ADJ”键即能自动置100%(T)，一次未到位可加按一次。

4.

改变操作模式本仪器设置有四种操作模式，开机时仪器的初始状态设定在透射比操作模式。（1）透射比: 测试透射比（2）吸光度: 测试吸光度（3）浓度因子: 设定浓度因子（4）浓度直读: 测试浓度和浓度直读

紫外分光光度计的使用方法

1、机器开关在机器的右侧，按一下就会打开，有个小的屏幕，可以按数字键来操作选项，测吸光值操作。

2、按数字键1，进入选项，有当前参数、吸光度等。

3、点击键盘上的GOTO键去设置，一般设置为600，输入直接按数字键就可以。输入之后按ENTER这个键，这个是确认键。

4、把样品放到比色皿里面，留一个比色皿方蒸馏水，将蒸馏水的比色皿放到第一个其余的依次放入。

5、盖上一起的盖子，拉环的位置正处于测定第一个比色皿的位置，这一步需要归零，按键盘上的ZREO键。

6、归零之后，开始依次用力拖动把手，显示屏上就会显示出对应的吸光度，依次纪录数值，就能完成测定吸光值的实验。

分光光度计的校正及正确使用方法

分光光度计的校正一直是一件非常必要的事情，这对于分光光光度计可以进行精确的测量起着非常关键的作用。分光光度计在进行测量的时候，如果有杂散光而且不经过处理的话，是非常影响实验的结果的，所以我们必须要了解分光光度计校正和使用的方法。

校正方式相关事项如下：因为外界的温度变化对机械部分时常会有影响，所以仅器波长经常会稍微的有些许的变动，所以我们必须定期的对所用仅器进行全面的校正检定，而且还应在测定前校正测定的波长。一般常用汞灯中的谱线为：237.83、275.28、253.65、296.73、334.15、365.02、313.16、435.83、546.07、404.66、576.96nm，或用氘灯的486.02rnn、656.10nm进行校正，钬玻璃在波长279.4、287.5、333.7处有尖锐吸收峰，可作波长校正，但正是由于来源不同，那么随着时间的推移就会产生微小的变化，所以在使用时必须要注意。对于吸光度的准确程度我们可以用硫酸溶液来检定。取铬酸钾约60mg，用0.005moI/L硫酸溶液稀释至1000mL，在规定波长处测定计算吸收系数，最后与规定的吸收系数比较。

使用方法：开机之后，仪器初始化结束后，选择光度测量，可进行固定波长吸光度的测量设定参数，依次选择测光方式、数学计算、试样测定等步骤。分光光度计还可进行空白溶液的校正、试样空白校正、试样池校正等。在参数设置完毕之后按“开始”键进入测量。测量之后可以根据需求打印出测试的结果。

如果分光光度计在校正过程中发生了故障，自己无法进行处理的，不要擅自拆卸或者修理，要记下故障前后的事情，然后等待专业的维修人员了解之后再进行修理维护。